高效液相色譜法是指具有高分離效能的柱液相色譜法。高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。

 

　　

HPLC儀器組成及流路圖

     
      對(duì)儀器的一般要求和色譜條件

 

　　高效液相色譜法所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。

 

　　色譜柱

 

　　反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對(duì)映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）。

 

色譜柱分離過(guò)程

　　
        使用微徑柱時(shí)，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。

 

　　以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過(guò)40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過(guò)60℃。

 

　　流動(dòng)相的pH值應(yīng)控制在2～8之間。當(dāng)pH值大于8時(shí)，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH值小于2時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機(jī)一無(wú)機(jī)雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當(dāng)需使用pH值小于2的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機(jī)－無(wú)機(jī)雜化填充劑等。

 

　　檢測(cè)器

 

　　最常用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器，其他常見(jiàn)的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。

 

　　紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。

 

　　紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

 

　　不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外－可見(jiàn)分光光度法（2010年版藥典二部附錄ⅣA）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求；采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動(dòng)相。

 

　　流動(dòng)相

 

　　反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相首選甲醇－水系統(tǒng)（采用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，首選乙腈－水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時(shí)，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動(dòng)相，必須使用時(shí)，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動(dòng)相。由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對(duì)于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

 

流動(dòng)相的使用選擇

　　各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中，調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對(duì)于自身的改變量不超過(guò)±30%且相對(duì)于總量的改變量不超過(guò)±10%為限，如30%相對(duì)改變量的數(shù)值超過(guò)總量的10%時(shí)，則改變量以總量的±10%為限。

 

　　對(duì)于必須使用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項(xiàng)下注明。

 

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