色譜方法如何建立？梯度方法如何調(diào)整？一直是困擾廣大色譜研究人員的一個(gè)問題，梯度方法怎么調(diào)整，注意問題有哪些？今天小編就與大家聊一聊梯度。
梯度洗脫的原理
典型的梯度洗脫是用兩種溶劑做流動(dòng)相，弱溶劑A和強(qiáng)溶劑B，在反相色譜分離中溶劑A大都是水，溶劑B是甲醇或者乙腈等強(qiáng)溶劑。所有的梯度洗脫中溶劑強(qiáng)度不斷增加，即B的濃度不斷增加。例如,流動(dòng)相中溶劑B的含量在一定時(shí)間內(nèi)梯度從20%提高到80%。梯度控制器決定流動(dòng)相的組成，可通過輸入不同的條件實(shí)現(xiàn)：
①流動(dòng)相(梯度洗脫開始時(shí)): cB(%);
②流動(dòng)相(梯度洗脫結(jié)束時(shí)): cB(%);
③從分離開始到結(jié)束的梯度時(shí)間;
④ 梯度形狀;
⑤流速。
梯度洗脫常用于分離極性范圍廣的組分，最后一個(gè)峰的等度保留必須大于第一個(gè)峰。在等度分離中，第一個(gè)峰與最后一個(gè)峰的k'比應(yīng)大于30，這樣用梯度才有好的結(jié)果。用等度分離在色譜圖中前面的峰擠在一起，后面的峰又拉得很開(圖a)。用梯度洗脫峰間的位置很平均，分離度好，后面的峰很窄，檢測方便(圖b)。在等度洗脫中前面峰的k'值很小，后面峰的k'很大，梯度洗脫使流動(dòng)相強(qiáng)度不斷變化改變了k'值。在梯度洗脫中，弱保留組分在弱流動(dòng)相中首先離開色譜柱，而強(qiáng)保留組分在強(qiáng)流動(dòng)相中最后離開色譜柱。
(a)梯度洗脫：甲醇-水,甲醇濃度從10%至100%;
(b)等度洗脫,甲醇-水,體積比=50:50;
1-苯;2-氯苯;3-對-二氯苯;4-1,2,3-三氯苯;5-1,3,5-三氯苯;6-1,2,4-三氯苯;7-1,2,3,4-四氯苯;8-1,2,4,5-四氯苯;9-四氯苯;10-六氯化苯
如果CB開始太大，先出來的峰分得不好，是開始出的峰k'太小。如果先出來的峰擠在一起，應(yīng)把開始的CB降下來。以最終CB值控制最后的峰的洗脫時(shí)間。
開始試驗(yàn)時(shí)很可能有一對或更多的峰未完全分開，就像等度分離那樣。也應(yīng)該像改善等度分離那樣改善梯度的分離度，可以優(yōu)化k'、N和α。雖然初接觸時(shí)不太適應(yīng)梯度洗脫模式，但實(shí)際上它比等度洗脫更為方便容易。用這種模式的主要困難是，選定依賴于開始和最后CB的k'值、梯度時(shí)間tG、柱體積Vm以及流速F。它們的關(guān)系如下:
梯度洗脫中，k'視為常數(shù)，在反相液相色譜中大約等于20，△CB(%)為最終的cB(%)減去開始的cB(%)。柱體積等于FtG(150mmX0.46cm柱大約1.5mL)。增加梯度時(shí)間和流速，減少柱長和梯度變化范圍就增加k'。在梯度洗脫中，增加k'就可獲得與等度分離相同的結(jié)果：寬峰、較長的分離時(shí)間、良好的分離度。
在梯度洗脫中增加N值也可增加分離度,用較長的柱、高效柱或減少流速可增加N值。根據(jù)上式改變柱長和流速會影響到k'。增加N值會導(dǎo)致較小的是k'值，從分離度方面考慮會有相反的作用。在梯度洗脫中增加N可以保持是k'值恒定。改變F或柱長，保持tGF/Vm恒定，則k'也會恒定。
梯度洗脫出現(xiàn)的問題
總體講，梯度洗脫中所出現(xiàn)的故障與等度洗脫非常類似，主要包括以下方面：第一是與儀器故障實(shí)驗(yàn)技術(shù)、色譜柱故障等有關(guān)；第二是由于試驗(yàn)條件不當(dāng)設(shè)置導(dǎo)致分離方面問題(分離度差、寬峰等)。下表匯總了梯度洗脫常見故障及解決方法。
現(xiàn) 象
問題
解決辦法
色譜圖前面的峰擠成一團(tuán),且分離度較差
起始流動(dòng)相太強(qiáng)
在開始的梯度中減少溶劑B的比例(%)
色譜圖中間峰分離度差
條件欠佳
增加k'、N和α,改變梯度時(shí)間、流速、柱長
色譜圖前面的峰保留不重復(fù)
柱平衡差
(1)增加兩次梯度之間的再生時(shí)間(2)—定的間隔進(jìn)樣
基線漂移
溶劑A和B有不同的紫外吸收值
(1)加非保留的紫外吸收劑以抵消溶劑吸收的波動(dòng);(2)用不同波長檢測;(3)用不同檢測器
在空白的梯度中有偽峰
試劑或流動(dòng)相不純
(1)用HPLC級試劑(2)純化流動(dòng)相的組分
部分色譜峰分離度突然變差
溶劑分層
用鍵合相柱代替多孔硅膠柱
(1)基線漂移
如果B溶劑(甲醇)比A溶劑(水)吸收大，梯度洗脫時(shí)基線上升，在低紫外波長檢測更加厲害。一個(gè)解決的辦法是加有紫外吸收的組分到A或B溶劑中，以均衡兩種溶劑的吸收。加紫外吸收劑的一個(gè)要求是在梯度洗脫條件下無保留。也可加氧化亞氮在A(水)中。在185nm?200nm 處檢測常加低濃度的硝酸鹽；在高檢測波長加周期表中高族的鹽(如溴酸鹽、 高碘酸鹽)。
(2)偽峰
在流動(dòng)相中存在有紫外吸收的雜質(zhì)，用梯度洗脫能分離出來，即不進(jìn)相關(guān)的樣品也照常出峰。如用普通的蒸餾水或含有雜質(zhì)的溶劑就會不斷出峰或基線漂移，建議用HPLC級的水和溶劑。
(3)溶劑分層
在梯度洗脫中用硅膠柱最易出現(xiàn)這種現(xiàn)象。若B溶劑活性很強(qiáng)(如丙醇)，A溶劑極性很弱(如正己烷)。在梯度初始階段B溶劑被柱所吸收，繼續(xù)梯度B溶劑就打破平衡。可能在色譜圖上某些點(diǎn)分離度明顯降低，個(gè)別峰特別窄，而兩側(cè)峰又比較寬。在窄峰這一點(diǎn)上，正好B溶劑破壞了平衡，然后又分層。分析時(shí)要注意選用對B溶劑吸收低的柱，用鍵合相的柱很少發(fā)生這種現(xiàn)象。
溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相，有些溶劑在一 定比例內(nèi)混溶，超出范圍就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。
梯度滯后體積
梯度滯后體積是指從溶劑配比完成點(diǎn)到色譜柱頭的系統(tǒng)體積，也可稱為延緩體積，相當(dāng)于在梯度運(yùn)行之前運(yùn)行一段等度條件。下圖是低壓梯度與髙壓梯度系統(tǒng)中滯后體積的示意圖。
滯后體積的差異是造成梯度重現(xiàn)性差和方法傳遞困難的根源之一。系統(tǒng)體積較大時(shí)，由于梯度的譜帶展寬作用，會改變預(yù)期的梯度形狀，使得不同HPLC系統(tǒng)之間難以進(jìn)行方法轉(zhuǎn)換。下圖是理想情況下和不太理想的梯度滯后曲線的示意圖。
傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)滯后體積一般在0.5mL?5mL范圍，通常采用4.6mm內(nèi)徑，150mm或更長的色譜柱，分析時(shí)間10min?20min之間或更長時(shí)，滯后體積的影響并不顯著。但是隨著柱長變短、內(nèi)徑變細(xì)，較大的滯后體積可能會引起保留時(shí)間明顯增加，色譜分離情況發(fā)生變化，因此，當(dāng)用細(xì)內(nèi)徑色譜柱進(jìn)行分離時(shí)，滯后體積太大會引起梯度變化的延遲。
