氣相色譜方法驗(yàn)證
所謂的方法驗(yàn)證，就是要證明所開發(fā)方法的實(shí)用性和可靠性。實(shí)用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡(jiǎn)單易操作，分析時(shí)間是否合理，分析成本是否可被同行接受等?？煽啃詣t包括定量的線性范圍、檢測(cè)限、方法回收率、重復(fù)性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度等。
下面就簡(jiǎn)單討論其中幾個(gè)可靠性參數(shù)：
1．方法的線性范圍
即檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品量(濃度)成正比的線性范圍，它主要由檢測(cè)器的特性所決定。原則上。這一線性范圍應(yīng)覆蓋樣品組分濃度整個(gè)變化范圍。線性范圍的確定通常是采用一系列(多于3個(gè))不同濃度的樣品進(jìn)行分析，以峰面積(或峰高)對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于0．99時(shí)，就可認(rèn)為足線性的，小于0.99時(shí)，就超出了線性范圍。一個(gè)好的GC定量方法，其線性范圍(以FID檢測(cè)器為例)可達(dá)10；，線性相關(guān)系數(shù)等于或大于0.9999。
2．方法的檢測(cè)限
檢測(cè)限(DL)是指方法可檢測(cè)到的最小樣品量(濃度)。一般的原則是按照3倍信噪比計(jì)算，即氣樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時(shí)，該樣品的濃度就被作為最小檢測(cè)限，與此對(duì)應(yīng)的該組分的進(jìn)樣量就叫做最小檢測(cè)量-此外。憶驗(yàn)證定量方法時(shí)，還將10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的樣品濃度叫做最小定量限，當(dāng)用于法規(guī)分析時(shí)，這一數(shù)據(jù)應(yīng)等于或低于法規(guī)方法所要求的實(shí)際樣品中待測(cè)組分的最低允許濃度。
檢測(cè)限的測(cè)定可用一個(gè)接近檢測(cè)限濃度的樣品進(jìn)行分析，據(jù)所得色譜峰的峰高來計(jì)算。設(shè)此時(shí)濃度為c、相應(yīng)的峰高為h(信號(hào)強(qiáng)度單位)、基線噪聲為N(與h的單位相同)，則檢測(cè)限可按下面公式計(jì)算：
c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h
噪聲的大小與儀器的性能，特別是檢測(cè)器及其電子電路的穩(wěn)定性直接相關(guān)，也與載氣的純度、色譜柱的性能及操作條件有關(guān)。噪聲的測(cè)定是在正常操作條件下，儀器穩(wěn)定時(shí)，將信號(hào)放大(降低衰減或放大縱坐標(biāo))來測(cè)量，一般是測(cè)定樣品出峰前后1min的基線噪聲。
作為分析方法，檢測(cè)限無疑是越低越好。為此，應(yīng)選擇靈敏度高的檢測(cè)器，使用高純度的載氣和輔助氣，同時(shí)要定期維護(hù)儀器，保持進(jìn)樣口和檢測(cè)器的清潔，保持色譜柱的性能。此外，仔細(xì)優(yōu)化分離條件、適當(dāng)加大進(jìn)樣量(如采用大體積進(jìn)樣技術(shù))也是降低檢測(cè)限的常用方法。
3．方法回收率
即方法測(cè)得的樣品組分濃度與原來樣品中實(shí)有濃度的比率。如果樣品未經(jīng)任何預(yù)處理，則回收率一般可不考慮。只有當(dāng)某些樣品組分被儀器系統(tǒng)不可逆吸附時(shí)，回收率才是需要考慮的問題。如果樣品經(jīng)過了預(yù)處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個(gè)方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。
回收率可用下述簡(jiǎn)單方法測(cè)定：配置一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其兩等分，其中一份按方法步驟進(jìn)行預(yù)處理，然后用GC分析。另一份則不經(jīng)頸處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測(cè)組分峰面積的比率乘以100即是該組分的回收率。有時(shí)實(shí)際樣品很復(fù)雜，特別是樣品基質(zhì)對(duì)預(yù)處理的回收率影響較大時(shí)，就必須用空白樣品基質(zhì)(確信不含待測(cè)物)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，比如測(cè)定廢水中有機(jī)農(nóng)藥殘留量時(shí)，就要采用不含農(nóng)藥的水作空白基質(zhì)，在其中加入已知量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行處理和分析。處理后測(cè)得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。
很顯然，回收率太低時(shí)會(huì)影響方法的檢測(cè)限。當(dāng)樣品處理過程較復(fù)雜時(shí)，應(yīng)分步測(cè)定回收率，最后針對(duì)回收率最低的步驟進(jìn)行方法改進(jìn)，以期提高整個(gè)方法的回收率。
4．方法重復(fù)性和重現(xiàn)性
重現(xiàn)性是指同一方法在不同時(shí)間、地點(diǎn)、不同型號(hào)儀器、不同操作人員使用寸所得結(jié)果的一致性。與此近似的另一個(gè)術(shù)語是重復(fù)性，常指同一個(gè)人在同一臺(tái)儀器上重復(fù)進(jìn)樣所得結(jié)果的一致性。事實(shí)上，二者常常混用，多數(shù)人不做嚴(yán)格區(qū)分。但大多數(shù)歐洲學(xué)者會(huì)嚴(yán)格區(qū)分二者的不同。我們認(rèn)為對(duì)現(xiàn)代儀器來說，分析重復(fù)性是容易實(shí)現(xiàn)的，而重現(xiàn)性則是更重要的，也是方法驗(yàn)證所必須考察的。重現(xiàn)性和重復(fù)性都用多次分析所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示。
方法的重現(xiàn)性應(yīng)包括多次連續(xù)進(jìn)樣分析的重復(fù)性、不同時(shí)間(天與天之間)分析的重復(fù)性、不同型號(hào)儀器之間的重現(xiàn)性和不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。作為方法開發(fā)人員，首先應(yīng)測(cè)定重復(fù)性，即在相同條件下連續(xù)進(jìn)樣5—10次，統(tǒng)汁待測(cè)組分的保留時(shí)間和峰面積(或峰高)的RSD，一般要求保留時(shí)間的RSD不大于1％，峰面積的RSD不大于5%。文獻(xiàn)報(bào)道的最佳重復(fù)性數(shù)據(jù)為保留時(shí)間的RSD小于0.1%，峰面積的RSD小于1%。
如果樣品要經(jīng)過預(yù)處理，還應(yīng)測(cè)定同一樣品多次處理的重復(fù)性。即同一樣品取3—5份做平行處理，看最后測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。這一RSD值應(yīng)不大于5％。當(dāng)然，有些工業(yè)分析要求不大于10％即可。至于天與天之間的重現(xiàn)性也不應(yīng)大于10%、
當(dāng)上述重復(fù)性滿足要求后，說明該方法在你的實(shí)驗(yàn)室是可靠的。要將此方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法推廣使用，還必須測(cè)定不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。當(dāng)這些重現(xiàn)性(RSD)都能滿足要求時(shí)。這一方法的可靠性就得到了較為滿意的驗(yàn)證。
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